大家好，今天来为大家分享原位杂交的一些知识点，和荧光原位杂交技术的原理的问题解析，大家要是都明白，那么可以忽略，如果不太清楚的话可以看看本篇文章，相信很大概率可以解决您的问题，接下来我们就一起来看看吧！

本文目录

1. 原位杂交技术的原位杂交的基本原理
2. 原位杂交和核酸杂交是一种吗
3. 原位杂交的原理是什么有何用途
4. 原位杂交的例子
5. 简述原位杂交的步骤。

一、原位杂交技术的原位杂交的基本原理

1、原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)。

2、RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体(Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。

二、原位杂交和核酸杂交是一种吗

核酸杂交方法是一种分子生物学的标准技术,用于检测DNA或RNA分子的特定序列（靶序列）.经典的核酸杂交方法是将DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上,与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记,在膜上杂交时,探针通过氢键与其互补的靶序列结合,洗去未结合的游离探针后,经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针.

经典的核算杂交方法主要包括：DNA印迹杂交（Southern blot）RNA印迹杂交(Northern blot)以及斑点杂交和原位杂交：

1、 DNA印迹杂交（DNA blot hybridization）——有两种核酸印迹法：

将DNA或RNA溶液直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上（斑点或狭线印迹）

经琼脂糖凝胶电泳将片段的DNA或RNA转移到膜上（Southern和Northern印迹法）.DNA在电泳前先用**性内切酶消化.

2、 RNA印迹杂交（RNA blot hybridization）：

RNA印迹杂交是一种检测已固定在滤膜上的总RNA或mRNA特定靶序列的技术.

将少量核酸样品点样在硝酸纤维素滤膜上,80℃烘烤后可牢固地固定在膜上,再用探针进行杂交.尼龙膜,特别是聚偏氟乙烯（PVDF）与DNA结合力更高,坚韧、易**作.点样可手工,也可用手工点样品.检测可用放射性探针自显影或非放射性探针显色.可用于DNA或RNA分析.

在保持细胞形态条件下,进行细胞内杂交,显影或显色.可用于DNA或RNA分析.荧光原位杂交（F**H）进行染色体DNA分析可用于生物学研究的许多领域以及临床细胞遗传学研究.其主要优点是不仅可以在细胞**的中期,而且可在**间期核中诊断染色体的变化.

广义的核酸杂交就是指非同源的核酸分子间的复性（氢键结合）过程.因此可以说,目前的基因检测技术,除了质普法外都或多或少的涉及了核酸杂交原理.如PCR的引物复性过程、基因芯片的杂交检测过程、基因测序的引物复性过程以及各种SNP检测方法等等.

三、原位杂交的原理是什么有何用途

1、原位杂交的原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)。

2、RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体(Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。

四、原位杂交的例子

对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行**筛选时，可采用该方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。（1）在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。

（2）用无菌**将各个菌落先转移至滤膜上，再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种（或打点）。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322）的菌落。

（3）倒置平板，于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。

（4）用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂，在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。

（5）用Parafilm膜封好主平板，倒置贮放于4℃，直至获得杂交反应的结果。

（6）裂解细菌，按本段下面所述方法，使释放的DNA结合于硝酸纤维素滤膜。（1）在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/L NaOH的小洼（0.75ml），使菌落面朝上，将滤膜放到小洼上，展平保鲜膜，使滤膜均匀湿润，让滤膜留于原处2-3分钟。

（2）用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜，用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/L NaOH重复步骤（1）。

（3）吸干滤膜，将滤膜转移到新的带有1mol/L Tris·Cl(pH7.4）的保鲜膜洼上。5分钟后吸干滤膜，再重复一次该步骤。

（4）吸干滤膜，把它转移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl(pH7.4）的保鲜膜小洼上5分钟后吸干滤膜，转移到一张干的滤纸上，置于室温20-30分钟，使滤膜干燥。

（5）将滤膜夹在两张干的滤纸之间，在真空烤箱中于80℃干烤2小时，固定DNA。

（6）将固定在膜上的DNA与32 P标记的RNA进行杂交。

3.杂交（1）盛有2×SSC的塑料盘同，将干烤的滤膜飘浮在液面上，彻底浸湿5分钟。

（2）将滤膜转到200ml预洗液的玻璃皿中。滤膜何叠在一起，放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿，放到位于培养箱内的旋转平台上。于50℃处理30分钟。在这一步及以后的所有步骤中，应缓缓摇动滤膜，防止它们粘在一起。

（3）用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片，以降低杂交背景而不影响阳性杂交信号的强度和清晰度。

（4）将滤膜转到盛有150ml预杂交液的玻璃中，在适宜温度（即在水溶液中杂交时用68℃，而在50%甲酰胺中杂交时用42℃）下，预杂交1-2小时。

（5）将32 P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟，迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。

（6）杂交结束后，去除杂交液，立即于室温把滤膜放入大体积（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗一次，同时应避免膜干涸。

（7）68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次，每次1-1.5小时。此时已可进行放射自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60分钟。

（8）把滤膜放在纸巾上于室温晾干后，把滤膜（编号面朝上）放在一张保鲜膜上，并在保鲜膜上作几个不对称的标记，以使滤膜与放射性自显影片位置对应。

（9）用第二张保鲜膜盖住滤膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小时。

（10）底片显影后，在底片上贴一张透明硬纸片。在纸上标记阳性杂交信号的位置，同时在不对称分布点的位置上作出标记。可从底片上取下透明纸，通过对比纸上的点与琼脂上的点来鉴定阳性菌落。

五、简述原位杂交的步骤。

1、原位杂交是应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织化学或免疫化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术。**作步骤如下：

2、(1)载片的清洁与处理载片的清洁很重要，特别不能有核酸酶的污染。为了在后续的杂交和冲洗等步骤中防止组织或细胞从载片上脱落，可以用多聚赖氨酸涂抹载片。

3、(2)组织与细胞的固定进行原位杂交的细胞或组织必须经过固定处理，常使用4%的多聚**

4、(3)探针对探针的设计与方法根据被测定的核苷酸序列来决定。同时为了探针的渗入，用于细胞与组织原位杂交的探针均比较短，而用于细胞染色体原位杂交，常使用较长的探针以增强杂交的信号。

5、(4)湿盒原位杂交中每张标本所用的杂交液比较少，为防止杂交体系中的液体蒸发造成杂交液浓缩，甚至干燥，故应该使用湿盒。

6、(5)细胞组织杂交前处理原位杂交遵循核酸杂交的一般原则，但不同的是由于组织和细胞中的核酸都与细胞内的蛋白质结合，以核酸蛋白复合体的形式存在，固定过程中固定液的交联作用使生物分子形成网格，影响探针的穿透力，阻碍杂交体的形成，因此必须使用去污剂和/或蛋白酶对组织和细胞进行部分消化以除去核酸表面的蛋白质，使探针获得最大的穿透力。

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